水中生化需氧量檢測方法
Contents |
方法概要
水樣在 20℃ 恆溫培養箱中暗處培養 5 天後，測定水樣中好氧性微生物在此期間氧化水中物質所消耗之溶氧（Dissolved Oxygen，簡稱DO），即可求得5天之生化需氧量（Biochemical Oxygen Demand，簡稱BOD5）。
適用範圍
干擾
- 酸性或鹼性之水樣會造成誤差，應使用氫氧化鈉或硫酸調整之。
- 水樣中若含餘氯會消耗溶氧而造成誤差，可以使用亞硫酸鈉排除干擾。
- 水樣中若含氰離子、六價鉻離子及重金屬等均會造成干擾，必須經過適當處理，否則不適宜生化需氧量之測定。
- 水樣中溶氧若過飽和會造成誤差。可將水溫調至 20 ℃，再通入空氣或充分搖動以去除干擾。
- 水樣中無機物質如硫化物及亞鐵之氧化作用會消耗溶氧而造成誤差；此外，水樣中還原態氮之氧化作用亦會消耗溶氧而造成誤差，但可使用硝化抑制劑以避免氧化作用。
- 水樣中若含肉眼可見之生物，應去除之。
設備
- BOD瓶：60 mL 或更大容量之玻璃瓶（以 300 mL 具玻璃塞及喇叭狀口之 BOD 瓶為佳）。於使用前應以清潔劑洗淨﹐然後以蒸餾水淋洗乾淨並晾乾。在培養期間應以水封方式隔絕空氣，其方式為添加蒸餾水於已加蓋玻璃塞之 BOD 瓶喇叭狀口。水封後應以紙、塑膠類杯狀物或薄金屬套覆蓋 BOD 瓶之喇叭狀口，以減少培養期間水分蒸發。（注意：為減少誤差，宜使用經校正體積且編碼相同之 BOD 瓶及瓶蓋。若瓶蓋無編碼，可自行刻記。）
- 恆溫培養箱：溫度可控制在 20 ±1 ℃，並可避光以預防 BOD 瓶中藻類行光合作用而導致水樣之溶氧增加。
- 溶氧測定裝置（參照水中溶氧檢測方法 - 疊氮化物修正法）。
試劑
- 磷酸鹽緩衝溶液：溶解 8.5 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4）、21.75 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4）、33.4 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4．7H2O）及 1.7 g 氯化銨於約 500 mL 蒸餾水中，再以蒸餾水稀釋至 1 L，此時 pH 值應為 7.2。本溶液或以下所述溶液中，若有生物滋長跡象時即應捨棄。
- 硫酸鎂溶液：溶解 22.5 g 硫酸鎂（MgSO4．7H2O）於蒸餾水中，並稀釋至 1 L。
- 氯化鈣溶液：溶解 27.5 g 氯化鈣於蒸餾水中，並稀釋至 1 L。
- 氯化鐵溶液：溶解 0.25 g 氯化鐵（FeCl3．6H2O）於蒸餾水中，並稀釋至 1 L。
- 硫酸溶液，1 N：緩緩加 28 mL 濃硫酸於攪拌之蒸餾水中，並稀釋至 1 L（注意：配製過程中會產生大量熱）。
- 氫氧化鈉溶液，1 N：溶解 40 g 氫氧化鈉於蒸餾水中，並稀釋至 1 L。
- 亞硫酸鈉溶液，約 0.025 N：溶解 1.575 g 亞硫酸鈉（Na2SO3）於 1 L 蒸餾水中。此溶液不穩定，須於使用當日配製。
- 硝化抑制劑：加 3 mg 之 2﹣氯﹣6﹣（三氯甲基）砒啶【2-Chloro-6-(trichloromethyl)pyridine﹐簡稱TCMP】於 300 mL BOD瓶內，然後蓋上瓶蓋，或加適量之 TCMP 於稀釋水中，使其最終濃度為 10 mg / L。純的 TCMP 溶解速率可能很慢，也可能浮在樣品表面。有些市售之TCMP較易溶於水樣，但其純度可能不是 100 ％，需調整其用量。
- 葡萄糖-麩胺酸標準溶液：溶解 0.1500 g 經 103 ℃ 烘乾 1 小時之葡萄糖及麩胺酸於蒸餾水中，並稀釋至 1 L。此溶液應於使用前配製。
- 氯化銨溶液：溶解 1.15 g 氯化銨於約 500 mL 蒸餾水中，以氫氧化鈉溶液調整 pH 值至 7.2，並用蒸餾水稀釋至 1 L。此溶液濃度為 0.3 mgN / mL。
- 碘化鉀溶液：溶解 10 g 碘化鉀於 100 mL 蒸餾水中。
- 稀釋水：水樣稀釋用。可使用去礦物質水、蒸餾水、經去氯後之自來水或天然水製備，製備方法參見步驟-(一)。
採樣及保存
水樣在採集後迄分析之保存期間內，可能會因微生物分解有機物質而降低BOD值。水樣若在採樣後 2 小時內開始分析，可不需冷藏，若因採樣地點遠離檢驗室而無法在 2 小時內開始分析，則水樣應冷藏於 4 ℃ 暗處，並儘可能在 6 小時內分析，但無論如何，水樣應於採樣後 48 小時內進行分析。分析前應將水樣回溫至 20 ±3 ℃。
步驟
（一）稀釋水之製備
取適量體積的水（參見五、試劑（十二）所述）於適當容器中，每 1 L 水中，加入磷酸鹽緩衝溶液、硫酸鎂溶液、氯化鈣溶液及氯化鐵溶液各 1 mL。所製備之稀釋水於使用前調整至 20 ±3 ℃，搖晃或通入經過濾且不含有機物質之空氣，使其溶氧達飽和；或亦可將製備之稀釋水置於具棉花塞蓋之瓶內，保存足夠時間，使其溶氧達飽和狀態。製備稀釋水時，應使用乾淨玻璃器皿，以確保稀釋水品質。
（二）稀釋水之貯存
水樣稀釋用的水（參見五、試劑（十二）所述）可以一直貯存至使用，只要其所製備之稀釋水空白值符合七、步驟（八）所規定之品質管制範圍，此貯存可以改善某些水源之品質，但對某些水源則可能因微生物滋長而導致品質退化。水源於加入營養鹽、礦物質和緩衝溶液後最好不要貯存超過 24 小時，除非稀釋水空白值一直能符合七、步驟（八）所規定之品質管制範圍。若稀釋水空白值超出品質管制範圍，應純化改良之或改用其他來源之水。
（三）葡萄糖 - 麩胺酸標準溶液之查核
BOD 之測定係屬一種生物檢定，因此，當毒性物質存在或使用於植菌之菌種不良時，均對 BOD 之測定結果有很大影響，例如蒸餾水經常會被銅污染或某些廢污水來源之菌種活性較弱，若使用此水源或菌種，均會導致較低之 BOD 測定結果。所以必須藉由測定葡萄糖 - 麩胺酸標準溶液之 BOD 值，以檢查稀釋水品質、菌種有效性及分析技術。測定葡萄糖 - 麩胺酸標準溶液之 2 ％ 稀釋液在 20 ℃ 培養 5 天之 BOD 值，查核其是否符合本檢測方法精密度與準確度之要求（BOD 值 198 ±30.5 mg / L）。
（四）植菌
1.菌種來源
使用於植菌之菌種必須含有對水樣中生物可分解性有機物質具氧化能力之微生物。家庭污水、廢水生物處理廠未經加氯或其他方式消毒之放流水及排放口之表面廢污水均含有理想的微生物，某些未經處理之工業廢水、消毒過之廢水、高溫廢水或極端 pH 值之廢水中之微生物均不足。理想菌種來源為廢水生物處理系統內之混合液或其放流水，若無法取得，可採用家庭污水為菌種來源，使用前須先在室溫下靜置使其澄清，靜置時間應在 1 小時以上，但最長不超過 36 小時，取用時應取上層液。若使用廢水生物處理系統內之混合液或其放流水時，採集後應加入硝化抑制劑。
某些水樣可能含有無法由家庭污水來源之菌種以正常速率分解之有機物質，此時應使用廢水生物處理系統內之混合液或其未經消毒之放流水作為菌種來源。若無生物處理設備，則取用放流口下方 3 至 8 公里處之水。若此菌種來源亦無法取得時，可以在實驗室內自行培養。實驗室內自行培養菌種時，以土壤懸浮物、活性污泥或市售菌種作為初始菌種，於經沈澱之家庭污水連續曝氣培養，並且每日增加少量污水添加量。然後以此菌種測定葡萄糖 - 麩胺酸標準溶液之 BOD 值，直至測值隨時間增加達到一穩定值且在 198 ±30.5 mg / L 範圍內，此即表示菌種培養成功。
2.植菌控制
所謂植菌控制即是將菌種液當成水樣測定其 BOD 值，從植菌控制之測值與菌種稀釋濃度計算菌種之溶氧攝取量，理想狀況下，做不同之菌種稀釋濃度且最大稀釋濃度要導致至少 50 ％ 之溶氧消耗。經培養 5 天後，將溶氧消耗量大於 2 mg / L 且殘餘溶氧在 1 mg / L 以上之植菌控制，以溶氧消耗量（mg / L）對應菌種體積（mL）作圖，可呈現直線關係，其斜率表示每 1 mL 菌種之溶氧消耗量，而截距則為稀釋水之溶氧消耗量，其必須小於 0.1 mg / L。或者，亦可將培養 5 天後，溶氧消耗量大於 2 mg / L 且殘餘溶氧在 1 mg / L 以上之植菌控制，將溶氧消耗量（mg / L）除以菌種體積（mL）並求其平均值。加入每一 BOD 瓶中菌種所導致之溶氧消耗量應介於 0.6 至 1.0 mg / L 範圍內，但所加入菌種量應調整至使葡萄糖-麩胺酸標準溶液之 BOD 值落在 198 ±30.5 mg / L 範圍內。水樣之總溶氧消耗量扣除菌種之溶氧消耗量才為水樣之實際溶氧消耗量。
（五）水樣前處理
1.含腐蝕性鹼（pH ＞ 8.5）或酸（pH ＜ 6.0）之水樣：以 1 N 硫酸或氫氧化鈉溶液將水樣之 pH 值調為 6.5 至 7.5，加入體積不可超過樣品體積之 0.5 ％。
2.含餘氯之水樣：水樣應儘可能在加氯消毒前採集，以避免水樣中含有餘氯。若水樣含有餘氯，可添加亞硫酸鈉（Na2SO3）溶液去除之。亞硫酸鈉溶液之使用體積可由下述試驗結果來決定：在每 1000 mL 中性水樣中加入 10 mL 1 + 1 醋酸溶液（或 1 + 50 硫酸溶液）及 10 mL 碘化鉀溶液，混合均勻後，以 0.025 N 亞硫酸鈉溶液滴定，當碘和澱粉指示劑所形成之藍色複合物消失時，即為滴定終點。亞硫酸鈉溶液之滴定體積，即為水樣除氯所需之亞硫酸鈉溶液用量。以亞硫酸鈉溶液除氯後 10 至 20 分鐘，須檢查水樣是否仍含有餘氯。（注意：過量之亞硫酸鈉溶液會形成需氧量，並會慢慢地與經氯化水樣中可能存在之有機氯胺化合物起反應）。
3.含毒性物質之水樣：某些工業廢水如電鍍廢水含有毒金屬，此類水樣需經過特殊處理。
4.含過飽和溶氧之水樣：低溫或發生光合作用之水樣，其在20 ℃ 之溶氧可能會大於 9 mg / L，可將水溫調至 20 ℃，再通入空氣或充分搖動以驅出過飽和之溶氧。
5.調整水樣溫度：水樣於稀釋前，應調溫至 20 ±1 ℃。
6.抑制硝化：可能需要添加硝化抑制劑之水樣包括經生物處理之放流水、以生物處理廠放流水植菌之水樣及河川水等。硝化抑制劑之使用量應記錄於檢驗報告中。
（六）水樣稀釋技術
原則上，稀釋後之水樣，經培養 5 天後，殘餘溶氧在 1 mg / L 以上，且溶氧消耗量大於 2 mg / L 時可靠性最大。依經驗以稀釋水將水樣稀釋成數種不同濃度，使殘餘溶氧及溶氧消耗量合於上述範圍。一般可由水樣測得之 COD 值來推算其 BOD 值及稀釋濃度。通常各種水樣之稀釋濃度為：嚴重污染之工業廢水 0.0 至 1.0 ％；未經處理及經沈澱之廢水 1 至 5 ％；生物處理過之放流水 5 至 25 ％；受污染之河川水 25 至 100 ％。水樣之稀釋方法有兩種，可先用量筒稀釋後，再裝入 BOD 瓶，或直接在 BOD 瓶中稀釋。
當以量筒稀釋水樣且必須植種時，可直接將菌種加入稀釋水或於稀釋水樣前將菌種加入量筒中，植種於量筒中可避免因增加水樣之稀釋濃度而降低菌種 / 水樣之比值；當直接在 BOD 瓶中稀釋水樣且必須植種時，可直接將菌種加入稀釋水或直接加入 BOD 瓶中。稀釋後，BOD 瓶中水樣體積若超過 67 ％，稀釋後水樣中之營養鹽可能不足而影響菌種活性，此時，於 BOD 瓶中直接以 1 mL / L （0.33 mL / 300 - mL BOD 瓶）比例加入營養鹽、礦物質與緩衝溶液。
1.以量筒稀釋水樣：若以疊氮化物修正法測定水樣之溶氧時，應以虹吸管小心吸取稀釋水（必要時稀釋水須植菌）於容量 1 至 2 L 之量筒中，裝填至半滿，並應避免氣泡進入。加入適當體積之已混合均勻水樣後，再加入稀釋水至刻度，小心攪拌均勻，並避免氣泡進入。以虹吸管吸取混合液，分別置於兩個 BOD 瓶中。先測定其中一瓶之初始溶氧，另一瓶則於水封後置於 20 ℃ 恆溫培養箱中培養 5 天，再測其溶氧。
2.直接在 BOD 瓶中稀釋水樣：以移液管取適當體積之已混合均勻水樣，分別置於兩個 BOD 瓶中，添加適量之菌種於個別 BOD 瓶中或稀釋水中，再以稀釋水（必要時稀釋水須植菌）填滿 BOD 瓶，如此，當塞入瓶蓋時，即可將所有空氣排出，而無氣泡殘留於 BOD 瓶內。當水樣之稀釋比率大於 1：100 時，水樣應先以量瓶作初步稀釋，然後再以 BOD 瓶作最後稀釋。若以疊氮化物修正法測定水樣之溶氧，則進行水樣稀釋時，須裝兩個 BOD 瓶，取其中一瓶測定初始溶氧，另一瓶則於水封後置於 20 ℃ 之恆溫培養箱中培養 5 天，再測其溶氧。
（七）初始溶氧之測定
若水樣含會迅速與溶氧反應之物質，則於稀釋水填滿 BOD 瓶後，應立即測定初始溶氧。若測定之初始溶氧未明顯地迅速下降，則水樣稀釋與測定初始溶氧之期間長短即非重要因素，但仍不應超過 30 分鐘。
（八）稀釋水空白
以稀釋水為空白試樣，以檢查未經植菌之稀釋水品質及 BOD 瓶之清潔。在檢驗每批水樣時應同時培養一瓶未經植菌之稀釋水。於培養前及培養後（20 ℃，5 天）測定溶氧，其溶氧消耗量不應超過 0.2 mg / L，最好在 0.1 mg / L 以下。
（九）培養
將稀釋後水樣、重複分析水樣、植菌控制、稀釋水空白及葡萄糖-麩胺酸標準溶液等樣品水封後，置於 20 ±1 ℃ 之恆溫培養箱內培養 5 天。
（十）最終溶氧之測定
將稀釋後水樣、重複分析水樣、植菌控制、稀釋水空白及葡萄糖 - 麩胺酸標準溶液在 20 ±1 ℃ 之恆溫培養箱培養 5 天後，測定其溶氧。
結果處理
經 5 天培養後，將溶氧消耗量大於 2 mg / L 且殘餘溶氧在 1 mg / L 以上之水樣，依是否植菌，選擇公式並計算生化需氧量。
1. 無植菌水樣之生化需氧量
BOD5（mg / L）=（D1-D2） / P
2. 植菌水樣之生化需氧量
BOD5（mg / L）=【（D1-D2）-（B1-B2）×f】 / P
D1：稀釋後水樣之初始溶氧（mg / L）
D2：稀釋後水樣經 20 ℃ 恆溫培養箱培養 5 天之溶氧（mg / L）
P=【水樣體積（mL）】 / 【稀釋後水樣之最終體積（mL）】
B1：植菌控制之初始溶氧（mg / L）
B2：植菌控制在 20 ℃ 恆溫培養箱培養 5 天之溶氧（mg / L）
f：添加於稀釋後水樣之菌種與添加於植菌控制之菌種兩者之比值
f=【稀釋後水樣中之菌種百分比（﹪）】 / 【植菌控制中之菌種百分比（﹪）】
若菌種直接添加於樣品或植菌控制之 BOD 瓶中
f=【稀釋後水樣中之菌種體積】 / 【植菌控制中之菌種體積】
若水樣有多個稀釋濃度符合溶氧消耗量大於 2 mg / L 且殘餘溶氧在 1 mg / L 以上，且較高稀釋濃度之水樣不含毒性跡象和明顯異常情況，在合理範圍內以平均值出具報告。
品質管制
- 管制極限：鑑於影響實驗室間比對測試的因素極多，BOD 之測試結果出入亦大，宜以實驗室間比測結果之標準偏差作為單一實驗室之管制極限。但亦可由每一實驗室各自建立自己的管制極限，其方法為每一實驗室在數週或數月內至少分析 25 個葡萄糖-麩胺酸標準溶液，計算其平均值及標準偏差，取平均值 ±3 倍標準偏差作為該實驗室日後測定葡萄糖 - 麩胺酸標準溶液之管制極限。將這些單一實驗室測試之管制極限與實驗室間比測之管制極限作比較，若其管制極限超出 198 ±30.5 mg / L 的範圍外時，應重估該管制極限，並研究問題所在。假如葡萄糖-麩胺酸標準溶液之 BOD 值超過管制極限範圍，則應捨棄使用該菌種及稀釋水所得之全部測定結果。
- 空白樣品、查核樣品、及樣品須同時測定。
- 基質與濃度相似之每批樣品或每 10 個樣品至少須執行 1 個查核樣品分析。
- 基質與濃度相似之每批樣品或每 10 個樣品至少須執行 1 個重複分析。
- 相關品質管制文件中應記錄保存時間及保存溫度。
精密度與準確度
（一）國內單一實驗室測定查核樣品之結果如下表所示：
| 葡萄糖-麩胺酸標準溶液（mg/L） | 葡萄糖-麩胺酸標準溶液之統計BOD值（mg/L） | 月回收濃度平均值（mg/L） | 月標準偏差平均值（mg/L） | 二重複分析樣品數 | 分析月數 |
| 300 | 198±30.5* | 189 | 8.7 | 58 | 14 |
資料來源：行政院環境保護署環境檢驗所例行檢驗之資料。
- 該統計值請參考十、精密度與準確度（三）。
（二）單一實驗室測定查核樣品之結果如下表所示：
| 葡萄糖-麩胺酸標準溶液（mg/L） | 葡萄糖-麩胺酸標準溶液之統計BOD值（mg/L） | 月回收濃度平均值（mg/L） | 月標準偏差平均值（mg/L） | 二重複分析樣品數 | 分析月數 |
| 300 | 198±30.5* | 204 | 10.4 | 421 | 14 |
資料來源：同本文之參考資料。
- 該統計值請參考十、精密度與準確度（三）。
（三）實驗室間比測：
在一系列的比測中，每次邀請 2 至 112 間實驗室（包括許多檢驗員及許多菌種來源），測定葡萄糖與麩胺酸 1 ： 1 混合之合成水樣在培養 5 天後之 BOD 值，合成水樣之濃度範圍為 3.3 至 231 mg / L。所得之平均值X及標準偏差 S 之回歸方程式如下：
X﹦0.658 ×添加濃度（mg / L）+ 0.280 mg / L
S﹦0.100 ×添加濃度（mg / L）+ 0.547 mg / L
以 300 mg / L 葡萄糖-麩胺酸標準溶液經培養 5 天為例，代入上式其 BOD 之平均值X為 198 mg / L，標準偏差 S 為 30.5 mg / L。（資料來源：同本文之參考資料）
參考資料
- American Public Health Association， American Water Works Association & Water Pollution Control Federation. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater，20th ED.，Method 5210B，pp.5-3～5-6.APHA， Washington，D.C.，USA. 1998.
